Cube
Biotech社は膜タンパク質に関して多様な経験と知識を有しており、スケールにかかわらずタンパク質発現・精製サービスをご提供可能です。
天然構造を保持し、機能的な膜タンパク質を大腸菌やバキュロウイルスを利用した昆虫細胞系で発現・精製することを可能にする技術を保有しているため、低コストでご希望の膜タンパク質を作製することができます。サービスはnon-GMPで提供されます。
サービスの開始時点で充分なヒアリングと検討、および調査が行われますため、ご希望の用途に沿った最適なタンパク質をお届けすることが可能です。
サービスは精製のみでも承ります。
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標準的なプロジェクトの内容は次のようになっておりますが、標準以外でもお客様のご要望・用途に応じて内容をカスタムしてご提供します。
精製後のナノディスク化や結晶化についても承ります。
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標準的な作業内容
1. 発現コンストラクトデザインと作製
最初に発現系を決定し、その発現系にあわせたコンストラクトをデザインします。発現系の選択では、お客様のご要望に応じて最適な系を選択致します。
コンストラクトとしては通常は野生型を発現する全長タンパク質配列を使用し、この配列を最適化して組み入れます。このコンストラクトの発現効率が悪い場合、次のコンストラクトの最適化を実施します。
- 対象遺伝子の入手・合成
- 発現系（大腸菌・昆虫細胞・無細胞系等）の検討・選択
- コンストラクトデザイン（コドン最適化、プロモータ等エレメント選択、タグ選択）：複数デザインします
- コンストラクト合成
2. コンストラクト最適化
上記で十分な発現が確認されない場合、発現コンストラクトの以下の部分が最適化されます。
- プロモータ(強弱、コントロールの厳密さ)
- アフィニティタグの選択と付加する位置の決定
- 発現効率が高いドメインの選択（ドメイン間の境界のスクリーニングを含む）
本ステップの成果物として、SDS-PAGEの結果を含むレポートをお届けします。
3. 発現スクリーニング
最も発現効率が良いコンストラクトをさらに最適化します。発現は最初小スケールかつハイスループットで実施し、以下の要素から最適な組み合わせを選択します。
- 発現コンストラクト
- 大腸菌株/細胞株
- 発現条件（培地、培養装置、培養容積、細胞密度、温度、酸素濃度等）
4. 精製条件スクリーニング
小規模で発現したタンパク質を用い、小規模の精製を実施します。
- 界面活性剤スクリーニング（ペプチドミセルの使用も可能）
- 粗精製
- バッファ最適化
- （必要な場合）カスタムレジン/磁気ビーズの作製
- アフィニティ精製
小規模なアフィニティ精製に引き続き、タグのアクセシビリティの確認、アフィニティレジンとの非特異的相互作用がないことの確認、予測される収量、得られたタンパク質の均一性等を確認するためにゲル濾過を実施します。
特定の構造を保持したタンパク質や特定の活性を示すタンパク質の選択的精製が必要であれば、カスタムでアフィニティレジンを作成し、使用します。
納品物にはSDS-PAGEやウェスタンブロットの結果を含む報告書が含まれます。
5. 特性解析
界面活性剤等で可溶化・安定化された膜タンパク質に関し、CD等分光学的なデータを測定し、立体構造が保持されていることも確認致します。
必要な場合、活性測定、リガンド結合試験、質量分析、SPR等の実験も可能です。
6. スケールアップ発現
最適化された発現条件をもとにmLレベルからLレベルまで培養をスケールアップします。
スケールアップに際して必要な培養基材や培養条件の最適化も行います。
7. スケールアップ精製
大規模スケールで発現されたタンパク質は、小規模精製で選択されたレジン、カラムや条件等を大スケール精製に最適化した精製システムを用いて精製されます。必要であれば2段階以上の精製ステップが採用されます。
8. ナノディスク化
膜タンパク質の安定化のためにナノディスク化をしてお届けすることも可能です。
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