試薬および製造原料の輸入販売 シングルセル解析

Every Cell Has A Story To Tell™

Ampli1™ Whole Genome Amplification(WGA)キットは、一つの細胞のトータルDNAを偏りなく完全に増幅することを目的として開発され、最適化されています。

一個に分離された細胞のDNAを基にして、すべての遺伝子についてアレルの双方を偏りなく増幅させることは容易ではありません。

ほとんどのWGA法では、ランダムプライマーを用いて無作為に増幅を行うため、二つのアレルの一方が優位に(偏って)増幅されるallelic dropoutが起こります。

このようなWGA法を使って信頼性のあるデータを得るには、変異(SNP)解析の場合は細胞100個以上をプールした試料を、コピー数変異(CNV)の場合は細胞10個以上をプールした試料を用いなければなりません。一方、Ampli1™ WGAで調製したDNAライブラリーでは優先的な増幅が生じず(図1)、たとえ一個の細胞を試料としてもSNPやCNVを解析することができます。

全ゲノムシーケンスにより ADO(allelic drop out)の頻度を調べたところ、Ampli1™ WGA Kitを使うと低く抑えることができ(2%)、Displacement Amplification(MDA)(~65%)と比較して顕著な差が認められました。

また、Ampli1™ WGA法で増幅されたゲノム配列の割合は、他のPCR法に比べて2倍ほど高くなりました(74% vs. 36%)。

Ampli1™ WGA Kitによるアレルの偏りのない増幅

Ampli1™ WGA Kitではアレルに偏りなく増幅されるのに対して、他の方法ではアレルの一方が優位に増幅するためallelic drop out(ADO)が生じることを示す模式図。
Ampli1™ WGA Kitでは、細胞溶解後、DNAを制限酵素で切断したのち、個々のDNA断片にアダプターを結合する。この1900万すべてのフラグメントに対して特異性の非常に高い一つのプライマーを加えて、同一チューブ内でPCRを行う。

Ampli1™ WGA Kitの特徴

・高い信頼性:
一つのPCRプライマーを用いることで、偏りのないアレルの増幅を実現しました。
・優れた再現性:
すべての反応を一本のチューブで行い、沈殿操作もないので、
テンプレートのロスを最小限に抑えられます。
・安定した性能:
試料には生きた細胞および固定した細胞が使え、両者に対して等しく機能します。

Ampli1™ WGA Kitは様々な細胞に使えます

新鮮な細胞だけでなく、FFPEから分離した腫瘍細胞や間質細胞のような固定/染色した細胞のDNAも増幅することができます。

加えて、白血球、CTC、精細胞、CSF、幹細胞、神経細胞、胎児由来細胞など多様な検体から分離した一つの細胞を用いた実験が、数百報告されています。さらに、Ampli1™ WGA Kitを使って固定した細胞や長期保存した細胞のWGAを行ったところ、WGA産物に顕著な質の低下が生じないことが示されました。

生細胞および固定細胞から確実に増幅
STRのある11の遺伝子座をマルチプレックスで解析し、STRと判定した割合(STR Call Rates:SCR)を求めた。Ampli1™ WGA Kitは生細胞だけでなく固定した細胞にも等しく適用できることが示された。

Ampli1™ WGA Kitワン-デイ プロトコール

細胞溶解後、DNAを制限酵素で切断し、得られた個々のDNAフラグメントにアダプターをライゲーションします。

一本のチューブ内ですべての反応を行います。増幅はすべてのフラグメントに共通な特異性の高い一つのPCRプライマーを用いて行います。

Ampli1™ WGA Kitで増幅した細胞一個のDNAを用いた 信頼性の高いシークエンシング

腫瘍細胞をスパイクしたコントロールおよびがん患者の検体から、Silicon Biosystems社のDEPArray™システムを用いて、腫瘍細胞と白血球を一個づつ分離しました。腫瘍細胞と白血球それぞれのゲノムDNAをAmpli1™ WGA Kit を使って増幅し、Torrent® AmpliSeq™Custom Panelよりシークエンスを行いました。
下記の表に示すように、ホモ接合(HM)およびヘテロ接合(HT)の遺伝子変異が認められました。
シークエンスの結果から、腫瘍細胞および白血球とも、allelic drop out(ADO)の頻度が低く、偽陽性がなく、変異型および野生型ともに等しく検出されることが示されました。

MCF7細胞で予想されたPIK3CAのヘテロ接合変異はすべての測定で検出されました。SW480細胞では、予想されたKRAS、TP53、KITを含め複数のホモ接合変異が検出されました。

        fixed fixed fixed fixed fixed fixed fixed live live live fixed fixed fixed
      gDNA WGA WGA WGA WGA WGA WGA WGA WGA WGA WGA WGA WGA WGA
Gene COSMIC ID Allele Call MCF-7 MCF-7 MCF-7 MCF-7 MCF-7 MCF-7 MCF-7 MCF-7 SW480 SW480 SW480 SW480 SW480 SW480
KRAS COSM520 Homozygous                 100 100 100 100 100 100
TP53 COSM10660 Homozygous                 100 100 100 100 100 100
SMAD4 COSM14167 Homozygous                   100 100 100 100 100
PIK3CA COSM763 Heterozygous 51 55 65 44 58 71 66 59            
PDGFRA COSM22413 Homozygous                 100 100 100 100 100 100
KIT COSM28026 Homozygous                 100 100 100 100 100 100

スパイクしたMCF-7およびSW480腫瘍細胞を一個に分離したのち、DNAを増幅してシークエンスを行った。
表は、Ampli1™ WGA Kitで増幅したDNAに最適化したIon AmpliSeq™ Cancer Hotspot Panel V2で解析できる、54遺伝子の~2800のCOSMICのホットスポット変異に対する結果の一部。

さまざまな手法の遺伝子解析に使えます

Ampli11™ WGA Kitで増幅したDNAは、研究において最も要求度の高い手法を使って、様々なゲノム解析に用いることができます。

手法

  • サンガーシークエンシング
  • aCGH
  • qPCR
  • 次世代シークエンシング

解析

  • シークエンシング
  • SNPおよび変異解析
  • STR
  • CNV
  • Loss of Heterozygosity

Ampli1™ QC Kit (Genome Integrity Index)

Ampli1™ QC Kitは、全ゲノム増幅(WGA)後のDNAに対してPCRを行うことで、WGAのクオリティーをチェックするキットです。WGAライブラリーの1本の短いDNAと3本の長いDNAの有無について調べることにより、WGAで得られたDNAが遺伝子解析の試料として適切であるか判定します。DNAの質が良い細胞では通常3本または4本のPCRバンドが検出されるのに対し、固定化した細胞やDNAの質が低下した細胞では検出されるバンドの数が減少します。バンドの数はGenome Integrity Indexと定義され、さまざまな遺伝子解析法に対する使用可能性やDNAの質を評価する指標となります。

Ampli1™ QC Kit増幅産物のアガロースゲル電気泳動の例

PCR産物の同定
ターゲット 染色体 アンプリコンの長さ(bp)
A 12p 91
B 5p 108-166
C 17p 299
D 6p 614

PCR産物の長さ

プロダクト インフォメーション

仕様

  • Ampli1™WGA KitおよびAmpli1™ QC Kit。それぞれ、50反応および200反応のキットがあります。

Ampli1™ Sequencing Kits

Silicon Biosystems社は、よく知られているがん関連遺伝子を検出するためのサンガー法によるシークエンスキットを開発しました。一個の細胞から変異を同定することができます。

Ampli1™ Sequencing Kitは、Ampli1™ WGAの特徴、すなわち制限酵素で切断したDNAからライブラリーが作られることを利用して設計されています。

Ampli1™ Sequencing KitはPCRを利用したアッセイで、高い感度と特異性を持ちます。

Ampli1™ Sequencing KitをAmpli1™ WGA Kitとともに用いると、一個の細胞から変異を正確に検出することができます。

  • Ampli1™ PIK3CA Seq Kit 50反応
  • Ampli1™ EGFR Seq Kit 20反応
  • Ampli1™ KRAS Seq Kit 100反応
  • Ampli1™ BRAF Seq Kit 100反応
  • Ampli1™ ALK Seq Kit 25反応
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